پاورپوینت معرفی تکنیکDGGE (pptx) 28 اسلاید

دسته بندی : پاورپوینت

نوع فایل : PowerPoint (.pptx) ( قابل ویرایش و آماده پرینت )

تعداد اسلاید: 28 اسلاید

قسمتی از متن PowerPoint (.pptx) :

DGGE & TTGE پاییز96 1 معرفی تکنیکDGGE Denaturing gradient gel electrophoresis یا DGGE: نوعی تکنیک مولکولی انگشت نگاری ژنتیکی است. تفکیک محصولات به دست آمده ازPCR با طول برابر بر اساس تفاوت های توالی در سال 1983 توسط Fischer و Lerman به منظور بررسی تغییرات تک بازی و پلی مورفیسم پایه گذاری شد. در سال 1993 توسط Muyzer در میکروبیولوژی استفاده شد. به منظور شناسایی جمعیت های پیچیده میکروبی از محصولات PCR ناحیه ی rRNA استفاده شد. ناحیه ی RNA ریبوزومی : - حضور در ژنوم همه ی میکروارگانیسم های شناخته شده - دارای ساختار حفاظت شده : ناحیه ی اتصال پرایمر - دارای نواحی متغیر : مورد استفاده در آنالیز های فیلوژنتیکی و تفکیکی 2 3 مراحل آزمایشات Muyzer : 1- استخراج DNA از نمونه ی محیطی 2- ناحیه ی V3 از زیر واحد کوچک ریبوزومی باکتری : هدف اتصال پرایمر 3- PCR 4- آنالیز محصولات PCR با DGGE 5-نتیجه : ایجاد الگوی پیچیده ای از باند ها : جمعیت باکتری های موجود 4 در DGGE , dsDNA در ژل آکریل آمید در معرض شیبی از محیط دناتوره کننده قرار می گیرد. - ترکیبی از دمای یکنواخت بین 50 تا 65 درجه ی سانتی گراد و شیب خطی مواد دناتوره کننده اوره و فرمامید DGGE از اساس فیزیکوشیمیایی جفت شدن باز ها استفاده می کند. (A = T و C ≡ G ) طی انجام DGGE با زیاد شدن غلظت مواد دناتوره کننده ، dsDNA ذوب می شود حرکت مولکول DNA به طور قابل ملاحظه ای به تاخیر می افتد. مولکول dsDNA در شیب دناتوره کننده حرکت می کند تا زمانی که دومین ذوبی از DNA که کمترین پایداری را دارد ذوب شود و مولکول منشعبی را به وجود آورد که سبب کاهش حرکت آن در ژل آکریل آمید می شود. دومین ذوب : - ناحیه ای با حدود bp50 تا 300 - همه ی نوکلئوتیدها دارای دمای ذوب ( Tm ) یکسان 5 6 وجود چندین دومین ذوب با Tm های متفاوت در مولکول : عدم شناسایی تفاوت های توالی در دومین های ذوب دیگر به غیر از ناپایدار ترین آن ها جدا شدن dsDNA در دومین ذوب با بالاترین Tm تک رشته شدن DNA حرکت آن در ژل مانند مولکول های ds تحت تاثیر طول آن ها قرار می گیرد تفاوت های اندک توالی سبب تغییر در حرکت الکتروفورز DNA نمی شود. تفکیک پذیری بهینه زمانی صورت می گیرد که ناحیه ی مورد بررسی در دومین ذوب با کمترین Tm قرار گیرد و مولکول DNA به طور کامل واسرشت نشود. 7 در سال 1985 Myers یک GC-clamp را به توالی ژنی مورد نظر خود متصل نمود. - اضافه کردن 30 تا 50 N ( C و G ) به انتهای ‘5 یکی از پرایمر های R ویا F - دارای Tm بالاتری نسبت به سایر توالی ها در طبیعت - باقی ماندن مولکول DNA در این بخش به صورت ds 8 Clamp شیمیایی - نشان دار کردن ‘5 یکی از پرایمر ها با ترکیبات فعال شونده با نور : Psoralen - قرار گرفتن بین بازهای dsDNA ← تابش UV ← اتصال کووالانسی - مزیت : هر دو پرایمر دارای طول برابر - معایب : 1- به دلیل ایجاد پیوند کووالان ، باند های DGGE قابلیت تکثیر مجدد مستقیم را ندارند. 2- آسیب به قطعات تکثیر شده توسط UV که باعث ایجاد چند باند یا اسمیر می شود. 9